基于PacBio的全长转录组测序,可实现全长转录本测序,使得基因可变剪接形式的识别成为可能,可对新基因及其isoform进行更全面的研究。全长转录组测序更侧重于mRNA结构的研究,能够准确获得mRNA的同源异构体、单碱基变异、可变剪接、同源基因、等位基因等信息;另外,它可通过全长覆盖的测序数据直接获得异构体信息,并与二代RNA-Seq方法相结合,将mRNA表达水平分析精确到每个异构体。

技术优势

不需要组装,获得全长转录本
无GC偏好性,结果更为真实可靠
测序准确度高,碱基准确率达99.999%
上机时间短,2小时即可测序完成

技术应用

有效地绘制复杂基因组的转录图谱,作为基因功能研究的参考序列;
绘制准确、全面的可变剪切图谱;
补充已注释基因组的基因注释结果;
研究复杂基因家族中不同基因的表达情况;
识别不同等位基因表达的转录本,从基因表达水平揭示等位基因对生物性状的控制模式。

技术路线

技术参数

样品要求 测序策略 项目周期
样品类型:RNA
样品总量:≥20ug
(单次建库)
样品浓度:≥200ng/ul
测序平台:PacBio RS II+HiSeq
测序文库:3个cDNA SMRT bell文库(2-4 SMRT Cell/文库,1-2kb、2-3kb、3-6kb)
参考指标:≥15万条full-length reads
建库测序:2个月
标准分析:1个月

相关案例

利用单分子全长转录组测序技术生成个人转录组

研究人员以三个家庭成员的类淋巴母细胞,GM12878、GM12891、GM12892细胞系为材料,基于PacBio RS II平台和Illumina平台对其进行转录组测序及比较分析。研究结果显示,PacBio平台long reads方法生成了最深且最长的单分子long-read数据集(平均读长为1,188 bp),通过这些转录组,研究开发出一名家庭成员的等位基因特异的全长转录组,他们能够区分两个等位基因,即使是复杂的基因如HLA;这种个人的转录组,将对了解个体生物学和疾病很重要。

图1 FCRLA基因的差异等位基因异构体

参考文献

Tilgner H, Grubert F, Sharon D, et al. Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014, 111(27): 9869-9874.